蛋白質(zhì)的功能研究涉及了許多方法，不過這類研究的第一步往往是表達(dá)目標(biāo)蛋白。日前，《BioTechniques》雜志的編輯們挑選了今年最受歡迎的五篇蛋白質(zhì)分析文章，其中有三篇提出了改善蛋白質(zhì)表達(dá)的實(shí)用方法。

1. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage

無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成(CFPS)系統(tǒng)，是快速獲得大量目標(biāo)蛋白的一種簡單途徑。與體內(nèi)蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比，CFPS更適合于高通量應(yīng)用。CFPS系統(tǒng)通常是細(xì)胞抽提物的水溶液，一般通過冷凍儲(chǔ)存，而這會(huì)占據(jù)大量的冷藏空間。凍干CFPS系統(tǒng)能夠顯著減少體積，解決它的冷藏問題。Bradley Bundy團(tuán)隊(duì)今年四月發(fā)表文章，詳細(xì)描述了凍干CFPS系統(tǒng)的各個(gè)步驟。這篇文章提出了一個(gè)簡單直觀的方案，用于凍干源自E. coli細(xì)胞提取物的CFPS系統(tǒng)。文章指出，凍干CFPS系統(tǒng)不僅能大大減少冷藏空間，而且凍干的提取物在室溫下更加穩(wěn)定，運(yùn)輸起來更為簡單。研究者們只需要給凍干粉加入水就可以獲得蛋白合成系統(tǒng)。

2. A technique to increase protein yield in a rabbit reticulocyte lysate translation system

在表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白的時(shí)候，人們往往更傾向于使用哺乳動(dòng)物無細(xì)胞系統(tǒng)，比如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(RRL)。這些系統(tǒng)能夠生成翻譯后修飾，而這種修飾是蛋白正常功能所必需的。不過RRL的主要問題在于，這個(gè)系統(tǒng)的蛋白產(chǎn)量比較低。添加提高翻譯產(chǎn)量的蛋白因子，是解決這個(gè)問題的一種途徑。

病毒在感染過程中會(huì)用蛋白因子上調(diào)宿主細(xì)胞的翻譯活性。Denis Kainov等人發(fā)現(xiàn)，這種因子很適合用來提高RRL的產(chǎn)量。他們選用了甲型流感病毒的NS1蛋白，這種蛋白能阻止宿主的翻譯機(jī)器關(guān)閉。研究人員將腦心肌炎病毒(EMCV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)添加到目標(biāo)mRNA上，然后向RRL系統(tǒng)中加入重組NS1，結(jié)果使蛋白產(chǎn)量提高了十倍。如此顯著的改善受到了RRL使用者們的一致歡迎。

3. Off-on polyadenylation strategy as a supplemental mechanism for silencing toxic transgeneexpression during lentiviral vector production

這篇文章描述了一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法。表達(dá)毒性轉(zhuǎn)基因的慢病毒載體可以用于基因治療，雖然起治療作用的轉(zhuǎn)基因需要在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)，但在載體生產(chǎn)過程中抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)是很有必要的。293T細(xì)胞是常用的慢病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)會(huì)顯著降低293T細(xì)胞的產(chǎn)量，因此必須被盡可能的沉默。

常用方法是使用組織特異性啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子只在目標(biāo)細(xì)胞有活性，在載體生產(chǎn)細(xì)胞中沒有活性。然而，這種方法并不總是那么有效。Bagnis等人為我們提供了另一種選擇，他們六月份發(fā)表的文章描述了一個(gè)新慢病毒載體，能夠在生產(chǎn)載體的293T細(xì)胞中強(qiáng)力沉默轉(zhuǎn)基因。研究人員精心布置了病毒控制元件的定位和方向，并構(gòu)建了缺乏多聚腺苷酸化信號(hào)的轉(zhuǎn)基因，以便達(dá)到強(qiáng)效沉默的效果。這種載體轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞之后，逆轉(zhuǎn)錄會(huì)使病毒控制元件重排，轉(zhuǎn)基因只需要一個(gè)多聚腺苷酸化信號(hào)就可以表達(dá)。這一技術(shù)將成為在慢病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞中抑制毒性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的有力工具。

4. Resolving acetylated and phosphorylated proteins by neutral urea Triton-polyacrylamide gel electrophoresis: NUT-PAGE

理解磷酸化、乙?；确g后修飾在蛋白功能調(diào)控中起到的作用，是研究真核蛋白的一個(gè)關(guān)鍵問題。這些修飾會(huì)改變蛋白所帶的電荷，可以通過等電聚焦(IEF)等電荷依賴性凝膠電泳進(jìn)行分析。然而，在許多情況下IEF需要SDS-PAGE的補(bǔ)充，以分辨電荷類似但質(zhì)量不同的蛋白，這無疑增加了實(shí)驗(yàn)的繁瑣性也提高了實(shí)驗(yàn)成本。TAU(Triton acetic acid urea) PAGE是一種基于尿素的凝膠電泳，能夠使蛋白變性并維持蛋白所帶的電荷，這樣的方法可以同時(shí)依據(jù)質(zhì)量和電荷將蛋白分離。這個(gè)方法的問題在于，TAU-PAGE的酸性不能很好的分析一些磷酸化蛋白。Buehl等人八月份發(fā)表的文章，描述了一種中性pH的尿素凝膠系統(tǒng)。他們開發(fā)的NUT(neutral urea Triton)-PAGE很簡單也很便宜，可以很好的分析酸性和堿性蛋白的磷酸化和乙?；问?。NUT-PAGE有望成為IEF、2-D PAGE之外的另一種選擇。

5. Investigation of membrane protein–protein interactions using correlative FRET-PLA

研究蛋白質(zhì)功能很多時(shí)候意味著要了解它們與其他蛋白的互作。分裂泛素系統(tǒng)(split ubiquitin system)等體外分析法可以初步鑒定膜蛋白之間的互作。不過免疫共沉淀這樣的標(biāo)準(zhǔn)方法并不適合對(duì)膜蛋白互作進(jìn)行驗(yàn)證，因?yàn)槟さ鞍纂x開細(xì)胞膜之后一般不能正?；プ?。

膜蛋白互作最好是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究，讓這些蛋白始終處于細(xì)胞膜中?？蛇x擇的分析方法主要有FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)和PLA(鄰位連接)。Ivanusic等人十月份發(fā)表的文章，向人們展示了這兩種方法結(jié)合而成的FRET-PLA技術(shù)。他們將兩個(gè)interactor分別融合在黃色熒光蛋白(YFP)和青色熒光蛋白(CFP)上，然后給蛋白標(biāo)記上不同的多肽，作為PLA時(shí)抗體結(jié)合的目標(biāo)。這一技術(shù)大大提高了定位膜蛋白互作的靈敏度和空間分辨率，能夠分辨納米級(jí)的鄰近程度。